【PCR】

【PCRの原理】

DNA合成反応は3段階からなる。

denature: 鋳型となるDNA2本鎖を加熱して変性し，1本鎖にする。

annealing: 増幅したい特定部位の両端に相補的な2種類のオリゴヌクレオチドプライマーを加えた状態で温度を下げると，プライマーがDNA鎖の相補的な部位と2本鎖を形成する

extension: ポリメラーゼはプライマー部位からDNA相補鎖を合成していく

酵素

耐熱性ポリメラーゼといえ，Taqポリメラーゼは30~35サイクルで失活する。

プライマー

プライマーデザインはprimer3で作成

通常のPCRでは，プライマーは20塩基前後の鎖長で，GC含量が50-60%程度で設計

nestedプライマー

一組のプライマー対で増幅される標的配列の内側に第２のプライマーをデザインし，最初のPCRで増えた生成物を希釈して新たな鋳型として第２のPCRを行う。この第２のプライマーをnestedプライマーと呼び，第２の反応をnested PCRと呼ぶ。

NEMO (IKBKG)のlarge deletionで見つけられない変異を検出する際にnested PCRを持ちいることがある。

Tm (melting temperature)

DNAの2本鎖が熱変性して1本鎖になる温度をTmという。アニーリング温度を下げすぎるとプライマーの非特異的なアニーリングが起こしやすくなるので，Tmは可能な限り高いことが望ましい。2つのプライマーのTmが異なる場合は，とりあえず低い方に合わせてTmを設定する。

１－１　熱変性

熱変性は94℃ x 30秒～1分を標準とする

ゲノムDNAのような長いDNAを鋳型とする場合は，鋳型DNAの変性を完全にするため，最初の熱変性を5分行ってから通常のサイクルに入る

非特異的増幅がみられる（Extra bandが増える）

・DNA量を減らす

・サイクル数を減らす